क्लस्टर गरिएको नियमित रूपमा अन्तर्क्रियात्मक छोटो प्यालिन्ड्रोमिक दोहोरिने (CRISPR) तेस्रो पुस्ताको जीनोम सम्पादन प्रविधि हो जसले यसको उच्च-थ्रुपुट परिणामहरूको साथ संसारमा क्रान्तिकारी परिवर्तन ल्याएको छ। यसलाई विभिन्न जैविक रोगहरू र संक्रमणहरूको उपचार गर्न प्रयोग गरिएको छ। विभिन्न ब्याक्टेरिया र अन्य प्रोकारियोटहरू (जस्तै आर्किया) मा पनि फेजहरू विरुद्ध बचाउन CRISPR/Cas9 प्रणालीहरू छन्। यो रिपोर्ट गरिएको छ कि CRISPR/Cas9-आधारित रणनीतिहरूले सम्भावित रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रतिरोध जीनहरू, ट्रान्सक्रिप्शन, र एपिजेनेटिक नियमनलाई लक्षित गरेर ट्रिपल नेगेटिभ स्तन क्यान्सर (TNBC) को वृद्धि र प्रगतिलाई रोक्न सक्छ। यी चिकित्सीय हस्तक्षेपहरूले TNBC मा पनि अवलोकन गरिएको औषधि प्रतिरोध जस्ता चुनौतीपूर्ण समस्याहरूलाई सम्बोधन गर्न मद्दत गर्न सक्छन्। हाल, भौतिक (माइक्रोइन्जेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन र हाइड्रोडायनामिक मोडहरू), भाइरल (एडेनो-सम्बद्ध भाइरस र लेन्टीभाइरस) र गैर-भाइरल (लिपोसोमहरू र लिपिड न्यानोपार्टिकल्स) जस्ता कोषहरूलाई लक्षित गर्न CRISPR/Cas9 डेलिभर गर्न विभिन्न विधिहरू प्रयोग गरिन्छ। ) - कणहरू)। TNBC को आणविक कारणहरूको अध्ययन गर्न विभिन्न मोडेलहरू विकास गरिएको भए तापनि, vivo मा जीनोम सम्पादन उपकरणहरू प्रदान गर्न संवेदनशील र लक्षित विधिहरूको अभावले तिनीहरूको क्लिनिकल प्रयोगलाई सीमित गर्दछ। संक्षेपमा, यो समीक्षाले अवस्थित प्रमाणहरूको आधारमा TNBC को लागि CRISPR/Cas9 उपचारको प्रगति, चुनौतीहरू, सीमितताहरू र सम्भावनाहरूको विस्तृत रूपमा जाँच गर्दछ। हामी TNBC को उपचारमा CRISPR/Cas9 रणनीतिहरूलाई कसरी सुधार गर्न सक्छ भनेर पनि हाइलाइट गर्छौं।
क्यान्सर अनियन्त्रित कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र चेकपोइन्टहरूमा अवरोध, र ट्यूमर सप्रेसर जीन (TSGs) मा उत्परिवर्तनहरू द्वारा विशेषता हो (म्याथ्यूज एट अल।, २०२२)। क्यान्सरका विभिन्न प्रकारहरू मध्ये, स्तन क्यान्सर महिलाहरूमा हुने क्यान्सरको सबैभन्दा सामान्य प्रकार हो र विश्वव्यापी रूपमा यसको मृत्युदर उच्च छ (वाक्स र विनर, २०१९)। स्तन क्यान्सर एक विषम रोग हो जसमा हिस्टोलोजिकल र जैविक सुविधाहरू, क्लिनिकल प्रस्तुतीकरण र व्यवहार, र उपचारको प्रतिक्रिया जस्ता विविध विशेषताहरू छन् (वेइजेल्ट एट अल।, २०१०)। स्तन क्यान्सर वर्गीकरणले स्तन क्यान्सर निदान र ट्यूमर रोगको निदानको लागि सटीक अन्तर्दृष्टि प्रदान गर्दछ। सामान्य बायोमार्करहरू र क्लिनिकोप्याथोलोजिकल सुविधाहरूको प्रयोग स्तन क्यान्सरको वर्गीकरणको लागि मुख्य मापदण्ड भएको छ (त्साङ र त्से, २०१९)। स्तन क्यान्सरको उपचारको लागि रोगको निदान र प्रतिक्रिया एस्ट्रोजेन रिसेप्टर (ER), प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (PR), मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर २ (HER2/neu), र हिस्टोलोजिकल ग्रेड, ट्यूमर प्रकार, र ग्रेड सहित धेरै कारकहरूद्वारा प्रभावित हुन्छ। आकार र लिम्फ नोड मेटास्टेसिस (अल-तुबैती, २०२०)। स्तन क्यान्सरका पाँच आन्तरिक आणविक उपप्रकारहरू पहिचान गरिएका छन्, जसमा लुमिनल ए, लुमिनल बी, HER2-समृद्ध, बेसल-जस्तै, र क्लाउडिन-लो (प्राट एट अल।, २०१५) समावेश छन्। TNBC क्यान्सरको एक आणविक उपप्रकार हो जसले सबै ER, PR, र HER2 व्यक्त गर्दैन (यिन एट अल।, २०२०)। यी रोगविज्ञान सुविधाहरू TNBC सँग सम्बन्धित छन्, जसले यसको द्रुत प्रगति र अन्य कुनै पनि प्रकारको स्तन क्यान्सर भन्दा बढी आक्रामक प्रकृति पुष्टि गर्दछ (फेंग एट अल।, २०१८)। थप रूपमा, पेरु एट अल (२०००) ले स्तन क्यान्सरलाई पुन: वर्गीकृत गर्न र स्तन क्यान्सरको पाँच आन्तरिक उपप्रकारहरू पहिचान गर्न माइक्रोएरे प्रविधि प्रयोग गर्यो (क्याडेनास, २०१२)। बेसल-जस्तै स्तन क्यान्सर स्तन क्यान्सरको एक उपप्रकार हो जसमा ट्रिपल-नेगेटिभ फेनोटाइप हुन्छ र द्रुत प्रगतिसँग सम्बन्धित छ। यो ध्यान दिनुपर्छ कि सबै बेसल-जस्तै स्तन क्यान्सरहरू सामान्यतया TNBC को रूपमा गलत निदान गरिन्छ, तर केवल 77% TNBC हुन्छन्; यसको विपरित, TNBC को 71-91% बेसल-जस्तै हुन्छन्, जसले यी दुई प्रकारका स्तन क्यान्सरहरू ओभरल्याप हुन्छन् र फरक वर्गीकरणहरू प्रतिनिधित्व गर्छन् भन्ने संकेत गर्दछ (वाङ डी.-वाई. एट अल., २०१९)। यसले रोगको निदान स्पष्ट पार्न र वर्तमान र भविष्यका उपचारहरूमा सम्भावित प्रतिक्रियाहरू पहिचान गर्न TNBC को विषमतालाई चित्रण गर्ने आवश्यकता सिर्जना गर्दछ। थप रूपमा, TNBC ले सबै स्तन क्यान्सरका केसहरूको 15-20% को लागि जिम्मेवार छ र 50 वर्ष मुनिका महिलाहरूमा बढी सामान्य छ। TNBC का लगभग 20% केसहरूमा BRCA1 वा BRCA2 उत्परिवर्तनहरू रिपोर्ट गरिएको छ (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017)। , 2020)। अध्ययनहरूले यो पनि देखाएको छ कि TNBC मा एक विशिष्ट प्रतिरक्षा सूक्ष्म वातावरण छ जसमा उच्च स्तरको भास्कुलर एन्डोथेलियल वृद्धि कारकहरू, ट्यूमर-सम्बद्ध म्याक्रोफेजहरू (TAMs), ट्यूमर-घुसपैठ गर्ने लिम्फोसाइट्स (TILs), र ट्यूमर वृद्धि र माइग्रेसनमा संलग्न अन्य अणुहरू समावेश छन्। त्यसकारण, TNBC को सूक्ष्म वातावरण बुझ्नु यसको रोगनिदान र उपचारको लागि महत्त्वपूर्ण छ (फ्यान र हे, २०२२)।
TNBC को रोगनिदानको मूल्याङ्कन गर्न र प्रभावकारी उपचार सुनिश्चित गर्न, ER, PR र HER2 पत्ता लगाउन इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) र स्तन नियोप्लाज्म पत्ता लगाउन म्यामोग्राफीमा आधारित सही निदान महत्त्वपूर्ण छ। यद्यपि, म्यामोग्राफीले नेक्रोसिस र फाइब्रोसिस जस्ता इन्ट्राट्युमोरल सुविधाहरूलाई पर्याप्त रूपमा चित्रण गर्न सक्दैन (दीपक सिंह एट अल।, २०२१)। कमजोर रोगनिदान र निदानले डाक्टरहरूलाई सही औषधिहरू लेख्नबाट रोक्छ (चौधरी, २०२०), TNBC भएका बिरामीहरूको हेरचाह सुधार गर्न विभिन्न रणनीतिहरू प्रयोग गरिन्छ। हाल, TNBC भएका बिरामीहरूमा दुई औषधिहरू, डोक्सोरुबिसिन र साइक्लोफोस्फामाइड प्रयोग गरिन्छ र राम्रो परिणामहरू देखाएका छन्। थप रूपमा, अन्य प्लेटिनम औषधिहरू प्रयोग गरिन्छ, जस्तै कार्बोप्लाटिन र सिस्प्लेटिन (सिकोभ एट अल।, २०१५)। यसको अतिरिक्त, TNBC को उपचारको लागि सम्भावित केमोथेरापी औषधिको रूपमा Olaparib, Velaparib, र PF-01367338 जस्ता PARP अवरोधकहरू प्रयोग गरिएको छ (Ishino et al., 2018)। Wnt/b-Catenin, NOTCH, र Hedgehog सिग्नलिंग मार्गहरू TNBC को घटना र प्रगतिमा संलग्न भएको रिपोर्ट गरिएको हुनाले, यी मार्गहरूमा औषधिहरूलाई लक्षित गर्नु एक महत्त्वपूर्ण रणनीति हुन सक्छ (Aysola et al., 2013)। यद्यपि शल्यक्रिया, विकिरण थेरापी र केमोथेरापी आज TNBC को उपचारको मुख्य आधार बनेको छ, लक्षित थेरापी, इम्युनोथेरापी, विभिन्न CRISPR-सम्बन्धित जीन सम्पादन उपकरणहरू जस्तै Cas9n, dCas9। , CRISPR/Cas12, प्राइम सम्पादन, र CRISPR/Cas9-लक्षित जीन थेरापी सहित नयाँ उपचारहरू विकास गर्न महत्त्वपूर्ण प्रगति भएको छ। यहाँ हामी TNBC को उपचारमा प्रयोग हुने विभिन्न CRISPR-सम्बन्धित जीन सम्पादन उपकरणहरूमा ध्यान केन्द्रित गर्नेछौं। तिनीहरूमध्ये, CRISPR/Cas9 ले व्यापक ध्यान प्राप्त गरेको छ।
Cas9n, जसलाई Cas9 nickase पनि भनिन्छ, CRISPR/Cas9 जीनोम सम्पादन प्रणालीबाट प्राप्त Cas9 प्रोटीनको आनुवंशिक रूपमा ईन्जिनियर गरिएको संस्करण हो (गुप्ता एट अल।, २०१९)। यसको मूल रूपमा, Cas9 प्रोटीनमा दुई न्यूक्लिज डोमेनहरू छन्: RuvC र HNH, जसको मुख्य कार्य दुवै DNA स्ट्र्यान्डहरूको क्लीभेज हो। यद्यपि, Cas9n मा, न्यूक्लिज डोमेनहरू मध्ये एक, HNH, आनुवंशिक रूपमा उत्परिवर्तित हुन्छ र निष्क्रिय हुन्छ। त्यसकारण, Cas9n को HNH डोमेन कार्यहीन रहन्छ। केवल RuvC डोमेन सक्रिय रहन्छ, जसले Cas9n लाई एकल DNA स्ट्र्यान्डहरूमा काट्न वा ब्रेकहरू सिर्जना गर्न अनुमति दिन्छ (ट्रेभिनो र झाङ, २०१४)। Cas9 को तुलनामा, Cas9n ले प्रभावकारी रूपमा अफ-लक्ष्य प्रभावहरू कम गर्न सक्छ र सेल मर्मत संयन्त्रहरूलाई सही रूपमा सुधार गर्न सक्छ। Cas9n विभिन्न समस्याहरू समाधान गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, जस्तै डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA मा विशिष्ट स्थानहरूमा ब्रेकहरू सिर्जना गर्ने। यस उद्देश्यको लागि, दुई Cas9n अणुहरू संयोजन र सँगै प्रयोग गरियो (Yee, २०१६)। मिश्रित वंश काइनेज ३ (MLK3) एक माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज हो जसले TNBC मेटास्टेसिसको समयमा एक प्रमुख नियामकको रूपमा काम गर्दछ (क्रोनन एट अल।, २०१२)।
MLK3 ले TNBC मेटास्टेसिसतर्फ डोऱ्याउने धेरै सिग्नलिङ मार्गहरू सक्रिय गर्न सक्छ। उदाहरणका लागि, c-Jun N-टर्मिनल किनेज (JNK) मार्गले कोशिका गतिशीलता र बाह्य कोशिका म्याट्रिक्स क्षयीकरणलाई नियमन गर्दछ, र MLK3 ले JNK मार्गलाई सक्रिय गर्दछ, जसले गर्दा कोशिका गतिशीलता बढ्छ र आक्रामक गुणहरू प्रदान गर्दछ (Rattanasinchai and Gallo, 2016)। MLK3 ले EMT लाई पनि नियमन गर्दछ। यो गर्न, यसले स्नेल, स्लग र ट्विस्ट जस्ता डाउनस्ट्रीम ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूलाई सक्रिय गर्दछ। यी कारकहरूले एपिथेलियल मार्करहरूको अभिव्यक्तिलाई रोक्छन् र मेसेन्काइमल मार्करहरूको अभिव्यक्तिलाई बढावा दिन्छन्, जसले मेटास्टेटिक फेनोटाइपको अधिग्रहण निम्त्याउँछ (Casalino et al., 2023)। MLK3 ले ECM पुनर्निर्माण र ECM लाई घटाउने म्याट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज (MMPs) जस्ता प्रोटीएजहरूको सक्रियतामा भूमिका खेलेको अवलोकन गरिएको छ। यसले ट्यूमर कोशिका आक्रमणलाई सहज बनाउँछ र टाढाका साइटहरूमा फैलिन्छ (Katari et al., 2019)। यसरी, अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि MLK3 ले TNBC मा महत्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। रट्टानासिनचाई र ग्यालोले MLK3 को भूमिका अध्ययन गर्न TNBC मोडेलहरू प्रयोग गरे र पत्ता लगाए कि यसले विशिष्ट संकेत मार्गहरू मार्फत क्यान्सर विकासलाई बढावा दिन्छ। तिनीहरूले MLK3 सम्पादन गर्न CRISPR/Cas9n प्रयोग गरे र TNBC मेटास्टेसिसमा उल्लेखनीय कमी अवलोकन गरे (रट्टानासिनचाई र ग्यालो, २०१६)।
dCas9, जसलाई प्रायः निष्क्रिय Cas9 भनिन्छ, Cas9 प्रोटिनको परिमार्जित व्युत्पन्न रूप हो। सक्रिय Cas9 भन्दा फरक, dCas9 मा एन्डोन्यूक्लिज गतिविधिको अभाव छ, जसले गर्दा यसले DNA डबल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू प्रेरित गर्न असमर्थ छ। त्यसैले, dCas9 लाई DNA अनुक्रममा कुनै परिवर्तन वा परिमार्जन बिना जीनोमको विशिष्ट क्षेत्रहरूलाई सटीक रूपमा लक्षित गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ (वाङ एट अल।, २०१६)। dCas9 मा, दुई एन्डोन्यूक्लिज प्रोटीनहरू, RuvC र HNH, महत्त्वपूर्ण एमिनो एसिड अवशेषहरूलाई दबाएर निष्क्रिय पारिन्छन्। (रिक्टर एट अल।, २०१६)। DNA क्लीभेज गतिविधिको अभावको बावजुद, dCas9 ले आनुवंशिक अनुसन्धान र जैव प्रविधिमा धेरै महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। उदाहरणका लागि, यसले जीनोमको विशिष्ट क्षेत्रहरूको दृश्यावलोकनलाई अनुमति दिन्छ, ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनलाई सहज बनाउँछ, र एपिजेनेटिक परिमार्जनहरूलाई बढावा दिन्छ (ब्रोकेन एट अल।, २०१८)।
ट्रान्सक्रिप्शन कारक ZEB1 (जिंक फिंगर ई-बक्स बाइन्डिङ होमियोबक्स १) ले एपिथेलियल-मेसेन्काइमल ट्रान्जिसन (EMT) को मध्यस्थतामा विशिष्ट र महत्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, जुन भ्रूण विकास, तन्तु मर्मत, र क्यान्सर प्रगतिको समयमा हुने सेलुलर प्रक्रिया हो। यसमा एपिथेलियल कोशिकाहरूलाई मेसेन्काइमल कोशिकाहरूमा रूपान्तरण समावेश छ, जसले गर्दा कोशिका आकारविज्ञान, गतिशीलता, आक्रामकता, आदिमा परिवर्तन हुन्छ। (वू एट अल।, २०२०)। ZEB1 ले E-क्याडेरिन र ओक्लुडिन जस्ता धेरै एपिथेलियल मार्करहरूलाई रोक्छ, जुन TNBC मा एपिथेलियल कोशिकाहरूको कोशिका-कोशिका आसंजन र ध्रुवता कायम राख्न जिम्मेवार छन् (मोरेनो-बुएनो एट अल।, २००८)। थप रूपमा, ZEB1 ले N-क्याडेरिन, भिमेन्टिन र फाइब्रोनेक्टिन (कोनराडी एट अल।, २०१४) जस्ता केही मार्करहरूलाई सक्रिय गर्दछ र Rho GTPases र म्याट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेसेस (MMPs) (हुआङ) जस्ता साइटोस्केलेटल पुनर्निर्माणमा संलग्न जीनहरूलाई पनि नियमन गर्दछ। et al., 2014)। 2022), यसको अतिरिक्त, यसले विभिन्न संकेत मार्गहरू जस्तै रूपान्तरण वृद्धि कारक-β (TGF-β), Wnt संकेतन, आदिलाई पनि असर गर्छ, जसले गर्दा TNBC मा ट्यूमर आक्रमण र मेटास्टेसिसलाई बढावा दिन्छ (चेन एट अल., 2016)। धेरै अध्ययनहरू र वैज्ञानिक प्रमाणहरूले संकेत गर्दछ कि ZEB1 मा TNBC को पत्ता लगाउने र चिकित्सीय हस्तक्षेपको लागि एक मूल्यवान एजेन्टको रूपमा ठूलो क्षमता छ। हालैको एक अध्ययनमा, Warah et al. ले TNBC मोडेल प्रयोग गरे र dCas9 द्वारा ZEB1 को पूर्ण दमन हासिल गरे। यसरी, तिनीहरूले धेरै उच्च विशिष्टता र इन भिभो अवस्थाहरूमा ZEB1 को लगभग पूर्ण निषेध अवलोकन गरे (Warah et al., 2023)।
CRISPR/Cas12 CRISPR/Cpf1 भनिने जीन सम्पादन उपकरण हो। यो CRISPR/Cas प्रणालीबाट लिइएको हो, जहाँ Cas12 शब्दले CRISPR-सम्बन्धित प्रोटीन १२ (भरतकुमार एट अल।, २०२२) लाई जनाउँछ, जुन Cas9 सँग पूर्ण रूपमा मिल्दोजुल्दो छ। फरक यति मात्र हो कि यसमा Cas12 प्रोटीन हुन्छ। Cas9 को तुलनामा, Cas12 मा जीन सम्पादन प्रक्रियाको क्रममा टाँसिने छेउहरू उत्पन्न गर्ने जस्ता केही अद्वितीय कार्यहरू छन्, जबकि Cas9 ले ब्लन्ट छेउहरू उत्पन्न गर्दछ (वाङ एट अल।, २०२१)। Cas12 को यो गुणले यसको विशिष्ट DNA हेरफेर प्रविधिमा योगदान पुर्याउँछ। लक्षित DNA लाई सटीक रूपमा पहिचान गर्न र काट्न सक्षम प्रोटीनको रूपमा, यसमा असाधारण बहुमुखी प्रतिभा छ, जसले यसलाई जीन सम्पादन सहित विभिन्न अनुप्रयोगहरूको लागि प्रभावकारी उपकरण बनाउँछ (Pickar-Oliver and Gersbach, २०१९)।
अन्य CRISPR भेरियन्टहरू जस्तै, CRISPR/Cas12 ले TNBC मा जीनहरूलाई बाहिर निकाल्न वा सक्रिय गर्न पनि सक्षम छ, जसले यसको रोगजनन वा उपचारको प्रतिक्रियामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्ने जीनहरूलाई लक्षित गर्दछ (याङ र झाङ, २०२३)। यो प्रक्रिया पूरा गर्न, एक गाइड RNA (gRNA) विकास गरिएको थियो जसले Cas12 लाई लक्षित जीनमा निर्देशित गर्दछ। एक पटक Cas12 ले आफ्नो लक्ष्यमा बाँधिएपछि, यसले DNA मा डबल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू परिचय गराउँछ र DNA मर्मत संयन्त्रहरू सक्रिय गर्दछ। मर्मत प्रक्रियाको क्रममा, गलत न्यूक्लियोटाइडहरू समावेश गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा जीन उत्परिवर्तन र कार्यको हानि हुन्छ (झाङ एट अल।, २०२१a)। थप रूपमा, जीनहरू सक्रिय गर्न Cas12 इन्जाइम (dCas12 भनिन्छ) को सुधारिएको संस्करण पनि प्रयोग गरिएको थियो। ट्रान्सक्रिप्शन एक्टिभेटरसँग संयोजन गरेर, निश्चित जीनहरूलाई प्रेरित गर्न सम्भव छ, जसले गर्दा तिनीहरूलाई सक्रिय पारिन्छ। यो प्रविधिमा ट्युमर सप्रेसर जीनहरूको सक्रियतालाई बढावा दिन ठूलो सम्भावना छ (सुल्तान एट अल।, २०२२)।
प्राइम सम्पादन एक नयाँ विकसित र अत्यन्तै उत्कृष्ट जीनोम सम्पादन प्रविधि हो। यो जीवको DNA लाई धेरै सटीक रूपमा परिमार्जन गर्न सक्षम छ (चेन र लिउ, २०२३)। प्राइम सम्पादन दुई मुख्य घटकहरूको एकीकरण मार्फत प्राप्त गरिन्छ: एक परिमार्जित CRISPR/Cas9 इन्जाइम र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज। CRISPR/Cas9 इन्जाइमको भूमिका जीनोममा सटीक साइटहरूलाई छनौट रूपमा लक्षित गर्नु हो, जबकि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले लक्षित स्थानमा DNA लाई पूर्ण रूपमा परिमार्जन गर्न मद्दत गर्दछ (हसन एट अल।, २०२१)। प्राइमर सम्पादन संयन्त्रमा, पहिलो चरणमा प्राइमर सम्पादन गाइड RNA (pegRNA) (स्ट्यान्डेज-बियर एट अल।, २०२१) को सिर्जना समावेश छ। यसमा लक्षित DNA मा इच्छित सम्पादन साइटसँग मेल खाने लक्ष्य अनुक्रम र RNA टेम्प्लेट समावेश छ। त्यसपछि pegRNA लाई प्राइमर सम्पादन न्यूक्लिज (PE2) सँग लक्षित कोशिकाहरूमा परिचय गराइन्छ। PE2 एक फ्यूजन प्रोटीन हो जसमा Cas9 इन्जाइम, रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज, र प्राइमर सम्पादन एडाप्टर (मार्टिन-अलोन्सो एट अल।, २०२१) समावेश हुन्छ। कोष भित्र, pegRNA र PE2 कम्प्लेक्सहरूले परिमार्जन गर्न चाहेको विशिष्ट DNA खोज्छन्। Cas9 इन्जाइमले DNA काट्छ र एकल स्ट्र्यान्डहरू मिलेर बनेको टेम्प्लेट सिर्जना गर्दछ (Choi et al., 2022)। रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजले DNA लाई सम्पादनको लागि तयार गर्न यो टेम्प्लेट प्रयोग गर्दछ। DNA प्रतिलिपि गर्नुको साथै, RNA टेम्प्लेट सम्पादन गर्न निर्देशनहरू पनि समावेश छन्। अन्तमा, नयाँ सिर्जना गरिएको DNA स्ट्र्यान्डलाई DNA मा ब्रेक मर्मत गर्न टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, जसको परिणामस्वरूप इच्छित परिमार्जन भएको परिवर्तन गरिएको DNA अनुक्रम हुन्छ (Ochoa-Sanchez et al., 2021)। प्राइमर सम्पादन संयन्त्रले जीनहरूमा व्यापक उत्परिवर्तन निम्त्याउन सक्छ। यसले बिन्दु उत्परिवर्तन, सम्मिलन, मेटाउने, र जीन प्रतिस्थापनलाई पनि लक्षित गर्न सक्छ (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023)। प्राइम सम्पादनले अघिल्लो जीनोम सम्पादन प्रविधिहरू भन्दा धेरै फाइदाहरू प्रदान गर्दछ। यसमा बढेको शुद्धता, कम अफ-टार्गेट प्रभावहरू, र DNA डबल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरूमा भर नपरीकन DNA सम्पादन गर्ने क्षमता समावेश छ (Anzalone et al., 2020)।
CRISPR/Cas9 प्रविधि मूल रूपमा ब्याक्टेरियालाई प्लाज्मिड स्थानान्तरण र फेज संक्रमणबाट जोगाउन विकसित गरिएको थियो र पछि जीनोम सम्पादनको लागि प्रभावकारी RNA-आधारित DNA लक्ष्यीकरण उपकरणको रूपमा पुन: प्रयोग गरिएको थियो (जियाङ र डुडना, २०१७)। यसको अतिरिक्त, CRISPR/Cas9 प्रणाली क्रमशः ५०% र ८७% ब्याक्टेरिया र आर्कियल जीनोमहरूमा उपस्थित भएको रिपोर्ट गरिएको छ (इशिनो एट अल।, २०१८)। CRISPR/Cas9 इन भिभो र इन भिट्रो मोडहरू प्रयोग गरेर कुनै पनि असामान्य आनुवंशिक अनुक्रमलाई मेटाउने, सम्मिलित गर्ने र सुधार गर्ने सम्भावित उपकरण हो (सबिट एट अल।, २०२१)। यसबाहेक, CRISPR/Cas9 लाई रुचिको लक्षित जीनहरूको लागि यसको विशिष्टताको कारणले अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणालीको हिस्सा देखाइएको छ (चेन र झाङ, २०१८)।
CRISPR/Cas9 मा Cas9 र एकल गाइड RNA (sgRNA) समावेश छन्। Cas9 धेरै प्रोटीन घटकहरू मिलेर बनेको एन्डोन्यूक्लिज हो। यसको अतिरिक्त, Cas9 मा अद्वितीय संरचनात्मक र संरचनात्मक गुणहरू छन् (Pacesa et al., 2022) किनकि यसमा दुई लोबहरू छन्: पहिचान (REC) र न्यूक्लिज (NUC)। REC लोबलाई थप तीन क्षेत्रहरूमा विभाजन गरिएको छ: REC1, REC2, र ब्रिज हेलिसहरू (Cromwell et al., 2018)। NUC मा तीन लोबहरू हुन्छन्, अर्थात् RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH र प्रोटोस्पेसर आसन्न मोटिफ (PAM) अन्तरक्रिया डोमेन (चित्र १) (Song et al., 2016)। sgRNA मा CRISPR RNA (crRNA) र ट्रान्सकोडिङ सानो RNA (ट्रेसर RNA) (चित्र १) सहित दुई घटकहरू हुन्छन्। sgRNA ले Cas9 प्रोटिनलाई connexins सँग जोडेर सक्रिय जटिल बनाउँछ, जसलाई प्रभावक जटिल पनि भनिन्छ (Richter et al., 2012)। crRNA एउटा १८-२० न्यूक्लियोटाइड आधार जोडी हो जसले लक्षित DNA अनुक्रमहरू पहिचान गर्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। यसको अतिरिक्त, crRNA ले लक्षित DNA सँग जोडी बनाउँछ, र tracrRNA ले लक्षित DNA लाई बाँध्न Cas9 न्यूक्लियोजको लागि स्क्याफोल्डको रूपमा काम गर्दछ (Manghwar et al., 2019)। अर्कोतर्फ, PAM अनुक्रममा ३ न्यूक्लियोटाइडहरू छन्, जसले प्रभावक जटिललाई DNA मा बाँध्न पुष्टि गर्छ, निर्दिष्ट गर्छ र मध्यस्थता गर्छ। Cas9 प्रोटीन जटिल उपयुनिटहरू RuvC र HNH मा उत्प्रेरक गतिविधि हुन्छ (Richter et al., 2012; Asmamaw र Zawdie, 2021)। Cas9 सबयुनिटको HNH न्यूक्लियोज डोमेनले crRNA सँग सम्बन्धित DNA स्ट्र्यान्डलाई काट्छ। RuvC न्यूक्लिज डोमेनले अन्य DNA स्ट्र्यान्डहरूलाई क्लीभ गर्छ र डबल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू (DSBs) उत्पन्न गर्छ, त्यसपछि दुई फरक DNA ब्रेक मर्मत संयन्त्रहरू सक्रिय हुन्छन् (जियाङ र डौडना, २०१७) (चित्र १)।
चित्र १. CRISPR/Cas9 (A) को सिंहावलोकन। CRISPR/Cas9 प्रणालीका घटकहरू: (i)। Cas9 एन्डोन्यूक्लिज लक्षित DNA अनुक्रम काट्न जिम्मेवार छ, (ii) crRNA र tra-crRNA chimeras को फ्यूजनबाट उत्पन्न हुने एकल गाइड (sg) RNA। (दुई)। Cas9 मा Rec I, Rec II, NUC लोब (HNH र Ruv C उप-घटक हुन्) र PAM अन्तरक्रिया डोमेन (C) जस्ता धेरै घटकहरू समावेश छन् जसमा सम्बन्धित कार्यहरू छन्। CRISPR/Cas9 प्रोटीन जटिलले DNA अनुक्रमहरूलाई गैर-पूरक र पूरक रूपहरू (D) मा विभाजन गर्दछ। CRISPR/Cas9 ले जीनोमलाई तीन चरणहरूमा सम्पादन गर्दछ: पहिचान, काट्ने र मर्मत। डिजाइन गरिएको sg-RNA ले Cas9 लाई मार्गदर्शन गर्दछ र पूरक घटक crRNA मार्फत इच्छित अनुक्रम पहिचान गर्दछ। Cas9 ले 5′-NGG-3′ मा PAM अनुक्रम पहिचान गर्दछ र DNA पगाल्छ, DNA-RNA हाइब्रिड बनाउँछ र क्लीभेज सक्रिय गर्दछ। Cas9 को HNH डोमेनले पूरक स्ट्र्यान्डलाई फाल्छ, र RuvC डोमेनले गैर-पूरक स्ट्र्यान्डलाई फाल्छ। CRISPR/Cas9 ले dsDNA लाई दुई तरिकाले तोडेर मर्मत गर्छ: गैर-होमोलोगस एन्ड जोइनिङ (NHEJ) र होमोलॉजी-निर्देशित मर्मत (HDR)। NHEJ ले विदेशी होमोलोगस DNA को अनुपस्थितिमा एन्जाइमेटिक प्रक्रिया मार्फत डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA मर्मत गर्छ, एक त्रुटि-प्रवण संयन्त्र जसले अनियमित DNA अनुक्रमहरू सम्मिलित गर्न वा हटाउन सक्छ। HDR धेरै विशिष्ट छ र होमोलोगस DNA टेम्प्लेटहरू आवश्यक पर्दछ।
CRISPR/Cas9-मध्यस्थ मर्मत मार्गहरूमा गैर-होमोलोगस एन्ड जोइनिङ (NHEJ) र होमोलॉजी-निर्देशित मर्मत (HDR) संयन्त्रहरू समावेश छन्। NHEJ एक त्रुटि-प्रवण मार्ग हो किनभने यसमा सम्मिलन वा मेटाउने समावेश छ र मर्मत संयन्त्रको क्रममा कुनै ढाँचा आवश्यक पर्दैन। यसले मानक प्रोटीनहरू उत्पन्न गर्न अनियमित न्यूक्लियोटाइडहरू प्रयोग गर्दछ (अब्बासी एट अल।, २०२१)। यो मर्मत प्रणालीमा KU कम्प्लेक्स, क्रस-पूरक प्रोटीन कम्प्लेक्स प्रकार ४ (XRCC-४), DNA एन्ड प्रशोधन इन्जाइम, र प्रोटीन किनेज DNA-PKcs (अब्बासी एट अल।, २०२१) जस्ता चार जटिलहरू हुन्छन्। KU जटिल प्रोटिनमा दुई उपयुनिटहरू छन्, Ku 70 र Ku 80, र NHEJ संयन्त्रमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, किनकि मर्मत संयन्त्र दुई उपयुनिटहरू (Ku 70 र Ku 80) लाई लक्षित DNA को ब्लन्ट वा लगभग ब्लन्ट छेउमा बाँधेर सुरु गरिन्छ (अब्बासी एट अल।, २०२१), चोटपटकको ठाउँमा अन्य NHEJ-सम्बन्धित कारकहरू भर्ती गर्न स्क्याफोल्डको रूपमा काम गर्दछ (यांग एट अल।, २०२०)। XRCC-4 र DNA लिगेस क्रमशः 334 र 911 एमिनो एसिडहरू मिलेर बनेको हुन्छ, र XRCC4-DNA लिगेस IV कम्प्लेक्सले DNA छेउहरूको लिगेसनलाई उत्तेजित गर्दछ (चटर्जी एट अल।, २०१५)। DNA अन्त्य प्रशोधन इन्जाइम, जसलाई पोलिनुक्लियोटाइड काइनेज 3′-फस्फेट पनि भनिन्छ, एक DNA अन्त्य प्रशोधन इन्जाइम हो। यसले DNA मा 3′P समूह हटाउन सक्छ र DSB मर्मतको क्रममा 5′OH समूहलाई फस्फोरिलेट गर्न सक्छ। यसमा SSB मर्मत मार्ग प्रयोग गरेर एकल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू (SSBs) को मर्मत पनि समावेश छ (Chatterjee et al., 2015)। प्रोटिन काइनेज DNA-PKcs एक DNA-निर्भर प्रोटिन काइनेज हो जसमा PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) र ataxia telangiectasia mutated (ATM) परिवारको उत्प्रेरक उपयुनिट, साथै ATM र Rad3-related ATRs समावेश छन्। स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू (DSBs) र एकल-स्ट्र्यान्ड ब्रेकहरू (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016)।
HDR एक अधिक सटीक र उपयुक्त मर्मत संयन्त्र हो किनभने जानकारी समरूप DNA डुप्लेक्सको अक्षुण्ण रूप प्रयोग गरेर प्रतिलिपि गरिन्छ, यद्यपि यसलाई सिस्टर क्रोमेटिडहरूको उपस्थिति आवश्यक पर्दछ। यो स्तनधारी कोष चक्रको S/G2 चरणको समयमा हुन्छ। HDR मुख्यतया खमीर प्रजातिहरूमा हुन्छ, तर NHEJ स्तनधारीहरूमा महत्वपूर्ण छ (बर्मा एट अल।, २००६; अब्बासी एट अल।, २०२१)। पूर्ण मर्मत संयन्त्र चित्र १ मा देखाइएको छ।
TNBC आनुवंशिक र एपिजेनेटिक असामान्यताहरूको कारणले हुने भएकोले, CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर घातक जीनोमिक/एपिजेनोमिक असामान्यताहरूको सुधार एक उचित उपचारात्मक दृष्टिकोण हुन सक्छ (चेन एट अल।, २०१९)। थप रूपमा, कोशिका-विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनमा संलग्न केही ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूले क्यान्सर कोषहरूको अद्वितीय विशेषताहरू प्रदर्शन गर्न सक्छन्, जसले सुझाव दिन्छ कि ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन क्यान्सर उपचारको लागि उत्कृष्ट दृष्टिकोण हुन सक्छ (Drost एट अल।, २०१७)। औषधि विकासको लागि आनुवंशिक, एपिजेनेटिक र ट्रान्सक्रिप्शनल दोषहरू जस्ता ट्यूमरका यी आणविक विशेषताहरूको शोषण गर्नाले क्लिनिकल परिणामहरू सुधार गर्न र स्क्रिनिङ लागत घटाउन सक्छ। CRISPR एक सम्भावित जीन सम्पादन उपकरण हो जसले क्यान्सर निम्त्याउने जीनोमिक लक्ष्यहरू पत्ता लगाउन र पहिचान गर्न मात्र सक्दैन, तर मानव कोशिकाहरूमा ओन्कोजीनहरू सम्पादन गर्न, दबाउन र एपिजेनेटिक रूपमा परिमार्जन गर्न पनि प्रयोग गर्न सकिन्छ (तालिका १) (अहमद एट अल।, २०२१)। ट्यूमर सप्रेसरहरू, ओन्कोजीनहरू, र औषधि प्रतिरोधसँग सम्बन्धित जीनहरू खोज्न धेरै CRISPR स्क्रिनहरू सञ्चालन गरिएको छ। विभिन्न TNBC ओन्कोजीनहरू सम्पादन गर्न CRISPR/Cas9 को प्रयोग चित्र २ मा देखाइएको छ।
चित्र २. CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर विभिन्न TNBC ओन्कोजीनहरूको जीन सम्पादन गर्दा ट्युमरको वृद्धि र मेटास्टेसिस कम हुन्छ। यी ओन्कोजीनहरूमा CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 र CXCR7, Crypto1, ROR1 र ST8SIA समावेश छन्, जुन TNBC को घटना र मेटास्टेसिसमा संलग्न छन्।
क्यान्सर कोशिका माइग्रेसन, आक्रमण, र एपिथेलियल-मेसेन्काइमल ट्रान्जिसन (EMT) ITGA9 सँग सम्बन्धित छन्। अघिल्ला अध्ययनहरूले देखाएका छन् कि ITGA9 नच मार्गमा एक प्रमुख खेलाडी हो र रबडोमायोसारकोमा मेटास्टेसिसमा रोचक भूमिका खेल्छ (मोलिस्ट एट अल।, २०२०)। थप रूपमा, ITGA9 स्तन क्यान्सर सहित धेरै ट्यूमर प्रकारहरूमा बिरामीको रोगनिदानसँग नजिकबाट सम्बन्धित पाइयो (वाङ जेड। एट अल।, २०१९)। थप रूपमा, ITGA9 को बायोइन्फर्मेटिक्स विश्लेषणले देखाएको छ कि TNBC मा यसको अभिव्यक्ति अन्य स्तन क्यान्सर उपप्रकारहरूको तुलनामा उल्लेखनीय रूपमा उच्च थियो। TNBC बिरामीहरूमा ITGA9 स्तर बढेको ट्यूमर मेटास्टेसिस र पुनरावृत्तिसँग सम्बन्धित छ। CRISPR/Cas9 द्वारा ITGA9 को नकआउटले क्यान्सर स्टेम सेल (CSC)-जस्तो गुणहरू, ट्यूमर एन्जियोजेनेसिस, ट्यूमर वृद्धि, र TNBC मा β-क्याटेनिन गिरावटलाई बढावा दिएर मेटास्टेसिस कम गर्यो (वाङ जेड। एट अल।, २०१९)।
क्रिप्टो-१ TGF-β परिवारको सदस्य हो र प्रारम्भिक भ्रूणजनन, स्टेम सेल मर्मतसम्भार, र क्यान्सर मेटास्टेसिसको लागि महत्वपूर्ण छ (इशी एट अल।, २०२१)। Tdgf-१ को रूपमा पनि चिनिन्छ, यो एक ओन्कोजेनिक GPI-एङ्कर गरिएको सिग्नलिङ प्रोटीन हो जुन आदिम स्ट्रीक, मेसोडर्म र एन्डोडर्मको गठनको नियमनमा संलग्न छ, साथै भ्रूणजननको समयमा शरीरका अंगहरूको विकासमा बायाँ/दायाँ असममितताको स्थापनामा संलग्न छ (झाङ एट अल।, २०२१b)। थप रूपमा, क्रिप्टो-१ लाई स्टेम सेल मार्करको रूपमा एपिथेलियल-मेसेन्काइमल ट्रान्जिसन (EMT) मा संलग्न भएको देखाइएको छ (झाङ एट अल।, २०२१b)। EMT भ्रूण विकास, फाइब्रोसिस र घाउ निको पार्ने जस्ता विभिन्न प्रक्रियाहरूको लागि मात्र होइन, तर क्यान्सर आक्रमण र मेटास्टेसिसको लागि पनि महत्वपूर्ण छ। थप रूपमा, क्रिप्टो-१ ले चार नच रिसेप्टरहरूसँग अन्तरक्रिया गर्ने र तिनीहरूको अनुवाद पछिको परिपक्वता बढाउने देखाइएको छ (ब्रान्डस्ट्याटर र मेलर्ड, २०१९)। नच सिग्नलिङ मार्ग मानव स्तन क्यान्सर कोषहरूको मर्मतसम्भारमा संलग्न भएको ज्ञात छ। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि क्रिप्टो-१ को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता नकआउटले क्यान्सरको वृद्धि र मेटास्टेसिसलाई दबाउँछ। त्यसकारण, क्रिप्टो-१ TNBC को लागि एक महत्त्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य बन्न सक्छ (कास्ट्रो एट अल।, २०१५)।
XCL12 प्रोटिन र यसको केमोकाइन रिसेप्टर CXC (CXCR4 र CXCR7) ले क्यान्सर कोषको प्रसार, वृद्धि, माइग्रेसन र आक्रमणमा विभिन्न भूमिका खेल्छन् (Wu et al., 2015)। यी केमोरेसेप्टरहरू इन भिभो र इन भिट्रो मोडेलहरू दुवैमा धेरै संकेत मार्गहरू मार्फत TNBC को विकाससँग सम्बन्धित छन् (Wu et al., 2015)। थप रूपमा, CXCR4 र CXCR7 को सक्रियता TNBC मा मेटास्टेसिसको लागि बढी संवेदनशीलता र कमजोर रोगको निदानसँग सम्बन्धित छ (Karn et al., 2022)। त्यसकारण, CXCR4 र CXCR7 को नकआउट TNBC सहित स्तन क्यान्सरको उपचारको लागि प्रभावकारी औषधि लक्ष्य जीन बन्न सक्छ। याङ एट अल द्वारा अध्ययन। याङ एट अल (2019) ले CXCR4 र CXCR7 जीनहरूलाई सह-नकआउट गर्न CRISPR/Cas9 प्रयोग गरे र पत्ता लगाए कि TNBC प्रसार, वृद्धि, माइग्रेसन र आक्रमण उल्लेखनीय रूपमा रोकिएको थियो (Yang et al., 2019)।
स्तन क्यान्सरको तन्तुहरूमा TNBC ओन्कोजीनको miR-3662 को बढ्दो स्तर अवलोकन गरिएको थियो (Yi et al., 2022)। miR-3662 को नकडाउनले स्तन क्यान्सरको ट्युमरको वृद्धि र मेटास्टेसिसलाई भिभो र इन भिट्रो दुवैमा रोक लगाउने देखाइएको छ (अग्रवाल र गुप्ता, 2021)। HBP-1 Wnt/-catenin सिग्नलिङको एक शक्तिशाली अवरोधक हो र TNBC कोषहरूको miR-3662-मध्यस्थता वृद्धिको लागि जिम्मेवार हुन सक्छ। हालै, Yi et al. ले पत्ता लगाए कि miR-3662-HBP1 अक्षले TNBC कोषहरूमा Wnt/-catenin सिग्नलिङ मार्गलाई नियमन गर्दछ (Yi et al., 2022)। यसको ट्युमर-विशिष्ट अभिव्यक्तिको कारण, miR-3662 TNBC को लागि सम्भावित चिकित्सीय लक्ष्य हुन सक्छ। यसरी, TNBC को उपचारको लागि नयाँ औषधिहरू विकास गर्न miR-3662 को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता नकडाउन एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण हुन सक्छ।
UBR5 एक 300 kDa न्यूक्लियोफोस्फोप्रोटिन हो जुन विभिन्न क्यान्सरहरूमा ट्यूमरजेनेसिस, मेटास्टेसिस, र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाको प्रमुख नियामकको रूपमा पहिचान गरिएको छ (शियरर एट अल।, २०१५; फु एट अल।, २०२३)। UBR5 लाई TNBC नमूनाहरूमा अत्यधिक अपरेगुलेट गरिएको रिपोर्ट गरिएको छ र यसको ubiquitin ligase गतिविधि मार्फत प्रसार प्रेरित गरेर ERα प्रकार्यलाई उत्तेजित गर्दछ (बोल्ट एट अल।, २०१५)। प्राथमिक TNBC नमूनाहरूको सम्पूर्ण एक्सोम अनुक्रम अध्ययनहरूले पनि UBR5 को बढ्दो अभिव्यक्ति देखायो, जसले TNBC को विकासमा यसको भूमिका सुझाव दिन्छ। थप रूपमा, UBR5 को CRISPR/Cas9-संचालित मेटाउनेले TNBC मेटास्टेसिसको महत्त्वपूर्ण अवरोध र प्रयोगात्मक माउस मोडेलहरूमा वृद्धि देखाएको छ। यसबाहेक, जंगली-प्रकारको माउस मोडेलमा UBR5 को समावेशले यसको पूर्ण कार्यक्षमता पुनर्स्थापित गर्यो, जबकि यो प्रभाव निष्क्रिय उत्परिवर्ती स्ट्रेनहरूमा अवलोकन गरिएको थिएन (लियाओ एट अल।, २०१७)। UBR5 को कमी कमजोर एन्जियोजेनेसिसको कारणले TNBC मा बढेको एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस र ट्युमर वृद्धिको अवरोधसँग सम्बन्धित छ। UBR5 को क्षतिको कारणले गर्दा, टाढाका अंगहरूमा ट्युमर फैलावट कम हुन्छ, र UBR5 ले मुख्यतया E-क्याडेरिन अभिव्यक्ति घटाएर असामान्य EMT लाई प्रेरित गर्दछ (झाङ र वेनबर्ग, २०१८)। हालै, E3 युबिक्विटिनेशन गतिविधिको अभावको कारणले गर्दा TNBC मा UBR5 लाई IFN-γ-प्रेरित PDL1 ट्रान्सक्रिप्शनमा धेरै महत्त्वपूर्ण कारक देखाइएको थियो। RNA ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणले पत्ता लगायो कि UBR5 ले IFN-γ मार्गसँग सम्बन्धित जीनहरूमा प्रणालीगत प्रभाव पार्न सक्छ र प्रोटीन किनेज RNA (PKR) र यसको सिग्नल ट्रान्सड्यूसरहरू र एक्टिभेटरहरूको सक्रियता स्तर बढाएर PDL1 ट्रान्सएक्टिभेसनलाई बढावा दिन्छ। ट्रान्सक्रिप्शन १ (STAT1) र इन्टरफेरोन नियामक कारक १ (IRF1)। यद्यपि, UBR5 र PD-L1 अभिव्यक्तिको CRISPR/Cas9-मध्यस्थता गरिएको संयुक्त पृथकीकरणले ट्युमर सूक्ष्म वातावरणमा गहिरो प्रभाव पार्ने गरी, केवल नाकाबन्दी भन्दा एक सिनर्जिस्टिक चिकित्सीय प्रभाव पार्छ (Wu et al., 2022)। यसरी, CRISPR/Cas9 UBR5 प्रकार्यलाई रोक्नको लागि एक महत्त्वपूर्ण उपकरण हुन सक्छ, जसले गर्दा TNBC मेटास्टेसिस र ट्युमर वृद्धिलाई दबाउन सकिन्छ।
ROR1 एक प्रकार I ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन हो जुन क्यान्सर र भ्रूण विकासको समयमा व्यक्त गरिन्छ र यसलाई ओन्कोफेटल प्रोटीनको रूपमा पहिचान गरिएको छ (निकोलस बोर्चर्डिंग, २०१४)। विभिन्न मानव क्यान्सरहरूको आक्रामक व्यवहार ROR1 को अपरेगुलेसनसँग सम्बन्धित छ। ROR1 लाई लक्षित गर्ने चिकित्सीय यौगिकहरू समावेश गर्ने इन भिभो र इन भिट्रो अध्ययनहरूबाट आशाजनक परिणामहरू प्राप्त भएका छन् (चियन एट अल।, २०१६)। स्तनको तन्तु बायोप्सीमा ROR1 mRNA को उच्च स्तर आक्रामक बेसल-जस्तै स्तन (BL) ट्यूमर र शरीरको अन्य भागहरूमा तिनीहरूको माइग्रेसनसँग पनि सम्बन्धित छ। यसबाहेक, ROR1 को अत्यधिक अभिव्यक्तिलाई TNBC को विकासको लागि एक भविष्यसूचक मार्करको रूपमा पहिचान गरिएको छ (चियन एट अल।, २०१६)। यद्यपि, TNBC वृद्धि र मेटास्टेसिसलाई दबाउन CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर ROR1 लाई मौन गर्नु एक प्रभावकारी रणनीति हुनेछ।
सियालिलेसन प्रक्रियामा ग्लाइकोकन्जुगेट्समा सियालिक एसिड थपिन्छ, जुन सियालिलट्रान्सफेरेज (STs) द्वारा उत्प्रेरित हुन्छ। ST8SIA1 ST परिवारसँग सम्बन्धित छ र लिम्फोसाइटिक ल्युकेमिया र कोलोरेक्टल क्यान्सर जस्ता विभिन्न रोगहरूको रोगजननमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ (चाङ एट अल।, २०१८)। RNA अनुक्रम विश्लेषणले देखाउँछ कि ST8SIA1 TNBC बिरामीहरूको स्तन तन्तुमा अत्यधिक अभिव्यक्त हुन्छ र ट्युमर सप्रेसर जीन p53 मा उत्परिवर्तनसँग सकारात्मक रूपमा सम्बन्धित छ, जसले TNBC को रोगजननमा योगदान पुर्याउन सक्छ (बट्टुला एट अल।, २०१७)। थप रूपमा, ST8SIA1 TNBC को मेटास्टेसिस र पुनरावृत्तिमा संलग्न छ, जसले सुझाव दिन्छ कि यसले TNBC को घटना र विकासमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ। TNBC को इन भिट्रो मोडेलमा, CRIPSR/Cas9 द्वारा ST8SIA1 को नकडाउनले वृद्धि र मेटास्टेसिसलाई रोक्छ (बट्टुला एट अल।, २०१७)। यसले सुझाव दिन्छ कि CRISPR/Cas9 TNBC को उपचारमा ST8SIA1 oncogene को कार्यलाई रोक्नको लागि एक महत्त्वपूर्ण उपकरण हुन सक्छ।
NAT1 एक मेटाबोलिक इन्जाइम हो जसले चरण II जेनोबायोटिक यौगिकहरूको गठनलाई उत्प्रेरित गर्छ र लगभग सबै मानव तन्तुहरूमा अभिव्यक्त हुन्छ। NAT1 ले सुगन्धित अमाइन सब्सट्रेटको अनुपस्थितिमा पनि एसिटाइल-CoA (एसिटाइल-CoA) लाई लक्षित गर्न कोफ्याक्टर फोलेट प्रयोग गर्न सक्छ (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014)। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि NAT1 ले स्तन क्यान्सर कोशिका मोडेलहरूमा म्याट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज 9 (MMP9) प्रकार्यलाई नियमन गर्दछ र ग्लुकोज भोकमरीको समयमा प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू (ROS) विरुद्ध सुरक्षा गर्दछ (Wang et al., 2018)। NAT1 को मेटाउँदा पाइरुभेट डिहाइड्रोजनेज जटिललाई रोक्छ, जसले माइटोकोन्ड्रियल डिसफंक्शन निम्त्याउँछ (Wang L. et al., 2019)। थप रूपमा, विभिन्न अन्य रिपोर्टहरूले देखाएको छ कि साना अणुहरू र siRNA मौनता प्रयोग गरेर NAT1 निषेधले स्तन क्यान्सर कोशिकाहरूको आक्रामकता र प्रसारलाई कम गर्न सक्छ (Stepp et al., 2018)। हालै, स्तन क्यान्सर कोष लाइन MDA-MB-231 मा NAT1 लाई दबाउन CRISPR/Cas9 प्रयोग गरिएको थियो, जसले यसको अभिव्यक्ति स्तरमा निर्भर गर्दै कोषीय चयापचयलाई असर गर्छ। यस अध्ययनले यो पनि देखाएको छ कि NAT-1 TNBC को प्रगति र मेटास्टेसिसको लागि महत्वपूर्ण छ (कार्लिसल एट अल।, २०२०)।
ओन्कोजीनहरूको समन्वित ट्रान्सक्रिप्शन सुपर एन्हान्सरहरू, ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू र सह-कारकहरू (Hnisz et al., 2015) द्वारा नियमन गरिन्छ। यसको अतिरिक्त, ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनको लागि CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, र CDK13 जस्ता साइक्लिन-निर्भर काइनेसेस (CDKs) को समूह आवश्यक छ। ती मध्ये, CDK7 RNA पोलिमरेज II को फास्फोरिलेसनमा संलग्न छ, जुन TNBC को रोगजननमा ओन्कोजीन ट्रान्सक्रिप्शनको सुरुवात र विस्तारको लागि धेरै महत्त्वपूर्ण छ। एक सेमिनल अध्ययनमा, CRISPR/Cas9 द्वारा CDK7 को मेटाउनाले TNBC लाई रोक्यो, जसले TNBC को रोगजनन CDK7 मा निर्भर छ भनेर संकेत गर्दछ (वाङ वाई. एट अल., 2015)।
अध्ययनहरूले देखाएको छ कि MYC र RBP (RNA बाइन्डिङ प्रोटीन) मा उत्परिवर्तनले एपोप्टोसिस निम्त्याउन सक्छ, जबकि MYC वा RBP मा एकल जीन उत्परिवर्तनले क्यान्सर कोषहरूको वृद्धिलाई असर गर्दैन (आइन्स्टाइन एट अल।, २०२१)। मानव जीनोममा १००० भन्दा बढी RBP हरू CRISPR/Cas9-आधारित पुस्तकालय प्रयोग गरेर जाँच गरिएको छ। ती मध्ये, ५७ RBP हरू अत्यधिक उच्च MYC स्तर भएका क्यान्सर कोषहरूको वृद्धिको लागि महत्त्वपूर्ण पाइयो (व्हीलर एट अल।, २०२०)। थप रूपमा, YTHDF2 TNBC कोषको वृद्धि कायम राख्नको लागि महत्त्वपूर्ण छ र उच्च MYC अभिव्यक्ति भएका क्यान्सर कोषहरूमा उच्च-स्तरीय ट्रान्सक्रिप्शन र अनुवादको समयमा मिथाइलेटेड ट्रान्सक्रिप्टहरूको मात्रा घटाउँछ। थप रूपमा, YTHDF2 क्यान्सर कोषहरूको लागि आवश्यक छैन, जुन TNBC बिरामीहरूको बाँच्नको लागि उच्च MYC स्तरहरूमा कम निर्भर हुन्छन् (आइन्स्टाइन एट अल।, २०२१), सुझाव दिन्छ कि यो TNBC लाई पार गर्न सक्ने औषधिहरूको लागि सम्भावित चिकित्सीय लक्ष्य हुन सक्छ।
जिंक फिंगर प्रोटीन (ZNFs) ले कुल मानव जीनोमको लगभग १% ओगटेको छ। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि ZNF ले कलेजोको क्यान्सर, स्तन क्यान्सर र कोलोरेक्टल क्यान्सर जस्ता विभिन्न क्यान्सरहरूमा कोशिका प्रसारलाई नियमन गर्न सक्छ (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017)। CRISPR नकआउटद्वारा उत्पन्न पुस्तकालयहरू स्तन क्यान्सर कोषहरूमा विभिन्न ट्युमर सप्रेसर जीन (TSGs) स्क्रिन गर्न प्रयोग गरिएको छ (Shalem et al., 2014)। त्यसबेलादेखि, CRISPR/Cas9 ZNF319-मेटाइएको स्तन क्यान्सर कोषहरूको ट्रान्सक्रिप्टोमिक अध्ययनले देखाएको छ कि ZNF319 एक ट्युमर सप्रेसर जीन हो जसले स्तन क्यान्सर प्रसारलाई कम गर्छ र त्यसैले विभिन्न सम्भावित संकेत संयन्त्र र अन्य जैविक कार्यहरूमा संलग्न छ (Wang L. et al., 2022)।
फेरोप्टोसिस एक प्रकारको प्रोग्राम गरिएको कोशिका मृत्यु हो जुन फलामको उपस्थितिमा निर्भर हुन्छ। यो ज्ञात छ कि फेरोप्टोसिसको विकास लिपिड पेरोक्साइडको उपस्थितिले प्रभावित हुन्छ। यसको अतिरिक्त, PKCβII ले प्रारम्भिक लिपिड पेरोक्सिडेशन प्रदर्शन गरेको रिपोर्ट गरिएको छ, र बढेको लिपिड पेरोक्सिडेशन फेरोप्टोसिससँग सम्बन्धित छ। CRISPR/Cas9-मध्यस्थ किनेज इनहिबिटरहरूको पुस्तकालयको स्क्रिनिङले पत्ता लगायो कि PKCβII लिपिड पेरोक्सिडेशनको प्रक्रियामा संलग्न छ, जुन MDA-MB-231 कोशिकाहरूमा फेरोप्टोसिसको लागि महत्त्वपूर्ण छ (झाङ एट अल।, २०२२)। त्यसकारण, यसले सुझाव दिन्छ कि CRISPR/Cas9 द्वारा PKCβII को नकआउट फेरोप्टोसिस-सम्बन्धित रोगहरूको उपचारको लागि सम्भावित ट्यूमर दमनकर्ता जीन लक्ष्य हुन सक्छ (झाङ एट अल।, २०२२)।
क्यान्सर रोगीहरूमा हुने लगभग ९०% मृत्युको लागि औषधि प्रतिरोध जिम्मेवार मानिन्छ र यो क्यान्सर उपचारमा प्रमुख चुनौतीहरू मध्ये एक हो (बुकोवस्की एट अल।, २०२०)। नतिजाहरूले औषधि प्रवाह, डीएनए मर्मत, एपोप्टोसिस र विभिन्न कोशिका संकेत मार्गहरूसँग सम्बन्धित पर्याप्त संख्यामा जीनहरू औषधि प्रतिरोधसँग सम्बन्धित छन् भनेर संकेत गर्दछ (हैदर एट अल।, २०२०)। ती मध्ये, धेरै जीनहरूलाई CRISPR/Cas9 उपकरणहरूद्वारा लक्षित गरिएको छ र औषधि प्रतिरोध घटाउन र क्यान्सर विरोधी उपचारहरूको प्रभावकारिता बढाउन आशाजनक परिणामहरू देखाएको छ (वाघारी-ताबारी एट अल।, २०२२)। थप रूपमा, उच्च-थ्रुपुट CRISPR/Cas9 जीन नकआउट स्क्रिनिङ पुस्तकालयहरू सम्भावित औषधि प्रतिरोध जीन लक्ष्यहरूको कार्य परिमार्जन गर्न संलग्न छन् (शालेम एट अल।, २०१५)। प्याक्लिटेक्सेल प्रतिरोध जीनहरू पहिचान गर्न, जीनोम-वाइड sgRNA लाइब्रेरी स्क्रिनिङसँग जोडिएको RNA अनुक्रमण आठ उम्मेदवार जीनहरू पहिचान गर्न प्रयोग गरिएको थियो, जसमा हिस्टोन डिएसिटाइलेज ९ (HDAC9) समावेश छ, जुन पुनरावर्ती TNBC भएका बिरामीहरूमा औषधि प्रतिरोधसँग सम्बन्धित छन् (B et al., २०२०)। अर्को अध्ययनमा, क्यान्सर प्रतिरोधी औषधिहरूद्वारा उपचार गरिएका TNBC बिरामीहरूको बाँच्ने क्रममा डिसेरिन/थ्रेओनिन र टायरोसिन प्रोटीन किनेज (DSTYK) को अभिव्यक्ति बढेको देखियो। यसबाहेक, DSTYK को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता नकडाउनले भिट्रोमा औषधि-प्रतिरोधी क्यान्सर कोषहरू (SUM102PT कोषहरू र MDA-MB-468 कोषहरू) र इन भिभो TNBC मोडेल (Ogbu et al., २०२१) को एपोप्टोसिसलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो।
TNBC मा MAPK मार्गको असामान्य सक्रियता भएता पनि, MEK-लक्षित उपचारहरूको क्लिनिकल प्रभाव कमजोर छ। CRISPR/Cas9 जीनोमिक लाइब्रेरी स्क्रिनले पत्ता लगायो कि PSMG2 (प्रोटोम एसेम्बली चेपेरोन 2) को अवरोधले TNBC BT549 र MB468 कोशिकाहरूलाई MEK अवरोधक AZD6244 मा संवेदनशील बनाउँछ। PSMG2 को CRISPR/Cas9 नकडाउनले सामान्य प्रोटीसोम प्रकार्यलाई परिवर्तन गर्यो, जसले गर्दा PDPK1 को अटोफेजी-मध्यस्थता विच्छेदन भयो, जसले गर्दा AZD6244 (MEK अवरोधक) र MG132 (प्रोटीसोम अवरोधक) द्वारा प्रेरित TNBC माउस मोडेलहरूमा ट्यूमर कोशिकाहरूलाई अझ सुधार गरियो। यसरी, ट्यूमर कोशिका प्रसार कम गर्न प्रोटीसोम र MAP किनेज (MEK) अवरोधकहरूलाई synergistically प्रशासित गर्न सकिन्छ (वाङ एक्स. एट अल., २०२२)।
TNBC प्रतिरोध निम्त्याउने जीनको कार्यमा भएको क्षतिको लागि स्क्रिन गर्न CRISPR/Cas9 पनि प्रयोग गरिएको छ (Shu et al., 2020)। Ge et al ले TNBC मा BET ब्रोमोडोमाइन अवरोधक (BBDI) JQ1 सँग उपचार गरिएको क्यान्सर कोषहरूको औषधि प्रतिरोधको संयन्त्रको व्याख्या गरे। CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर, उनीहरूले पत्ता लगाए कि rb1 जीन मेटाउँदा TNBC क्यान्सर विरोधी औषधि JQ1 को प्रतिरोधी बन्न पुग्यो। त्यसकारण, TNBC मा JQ1 औषधिहरूको प्रतिक्रियामा rb1 प्रकार्य महत्त्वपूर्ण छ। उनीहरूले यो पनि रिपोर्ट गरे कि प्याक्लिटेक्सेल एक CDK4/6 kinase/microtubule अवरोधक हो, र JQ1 जस्ता BBDI सँग यसको संयोजनले औषधि-प्रतिरोधी TNBC लाई आशाजनक चिकित्सीय प्रतिक्रियाहरू प्रदान गर्न सक्छ (Ge et al., 2020)।
लामो ननकोडिङ आरएनए (lncRNA) को ट्रान्सक्रिप्शनल परिदृश्य TNBC मा नियोएडजुभेन्ट थेरापीको प्रतिरोधको लागि जिम्मेवार रहेको रिपोर्ट गरिएको छ। यस अध्ययनले देखाउँछ कि TNBC मा पाँच फरक MALAT1 lncRNA ट्रान्सक्रिप्टहरू अत्यधिक रूपमा व्यक्त गरिएका छन्। थप रूपमा, MALAT1 को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता मेटाउँदा TNBC BT-549 कोशिकाहरूको प्याक्लिटाक्सेल र डोक्सोरुबिसिनप्रति संवेदनशीलता बढ्यो, जसले TNBC मा MALAT1 प्रतिरोधको लागि सम्भावित भूमिकाको सुझाव दिन्छ (शाथ एट अल।, २०२१)।
BRCA1 (BRCA1m) मा उत्परिवर्तनहरू विषम छन् र त्यसैले पत्ता लगाउन गाह्रो छ। BRCA1 को सिंथेटिक घातक साझेदार PARP1 (poly(ADP-ribose) पोलिमरेजलाई लक्षित गर्दा, TNBC औषधि केमोसेन्सिटिविटी बढ्न सक्छ। CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर, PARP1 लाई मेटाउँदा doxorubicin, gemcitabine र docetaxel जस्ता क्यान्सर प्रतिरोधी औषधिहरूको mBRCA1 उत्परिवर्तित TNBC कोशिकाहरूमा संवेदनशीलता बढ्यो, जसले सुझाव दिन्छ कि PARP1 TNBC मा औषधि प्रतिरोधमा पनि संलग्न छ (Vaghari-Tabari et al., 2022)। ट्युमर सप्रेसर जीन BRCA1 वा BRCA2 मा उत्परिवर्तनहरूले मानिसहरूमा स्तन क्यान्सर हुने सम्भावना बढाउन जानिन्छ। यी बिरामीहरूको उपचारको लागि PARP अवरोधकहरूको प्रयोग आवश्यक पर्दछ। थप रूपमा, यो प्रदर्शन गरिएको छ कि CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर न्यूक्लियोटाइड साल्भेज फ्याक्टर DNPH1 को नकआउटले विषाक्त न्यूक्लियोटाइड 5-हाइड्रोक्सीमेथिलडिओक्स्युरिडाइन (hmdU) मोनोफोस्फेट हटाउन सक्छ, जसले गर्दा PARP अवरोधकहरू (Fugger) प्रति संवेदनशीलतामा BRCA-कमी कोशिकाहरूको प्रतिक्रिया बढ्छ। et al., 2021)। यसरी, CRISPR/Cas9 र PARP1 अवरोधकहरू TNBC को लागि एक महत्त्वपूर्ण उपचार रणनीति बन्न सक्छन्।
पेनिट्रन्ट ग्लाइकोप्रोटिन (P-gp) जीन एक बहुऔषधि प्रतिरोधी जीन हो जुन सामान्यतया सबै TNBC को लगभग ४१% मा अपरेगुलेटेड हुन्छ (सन एट अल।, २०२०)। P-gp-प्रेरित औषधि प्रवाहलाई स्तन क्यान्सरमा औषधि प्रतिरोधको प्रमुख नियामकको रूपमा पहिचान गरिएको छ। P-gp अवरोधकहरूले स्तन क्यान्सरमा क्यान्सर प्रतिरोधी औषधिहरूप्रति बढ्दो संवेदनशीलता प्रदर्शन गरेका छन् (फाम्टा एट अल।, २०२१)। यसरी, TNBC मा औषधि प्रतिरोधलाई पार गर्न CRISPR/Cas9-मध्यस्थता गरिएको पृथकीकरण वा P-gp र P-gp अवरोधकहरूको दमन धेरै महत्त्वपूर्ण विधिहरू हुन सक्छन्।
ATP-बाइन्डिङ क्यासेट ट्रान्सपोर्टर G2 (ABCG2) ले TNBC मा औषधि प्रतिरोध निम्त्याउने कुरा थाहा छ (Palasuberniam et al., 2015), यद्यपि CRISPR/Cas9 र ABCG2 को मौनता र ट्युमर दमन गर्ने जीन निष्क्रियता बीचको सम्बन्धको बारेमा हाल कुनै रिपोर्ट छैन। PTEN ले ABCG2 सक्रियता बढाउन सक्छ (Palasuberniam et al., 2015), (Deakak Singh et al., 2021)। त्यसकारण, ABCG2 हटाउन CRISP/Ca9 प्रयोग गर्नु र यसलाई ABCG2 अवरोधकसँग संयोजन गर्नु TNBC मा औषधि प्रतिरोधलाई पार गर्न उपयुक्त उपचार हुन सक्छ। तालिका २ ले सबै प्रतिरोध जीनहरूलाई लक्षित गर्दै CRISPR/Cas9 उल्लेख गर्दछ।
तालिका २. CRISPR/Cas9 ले क्यान्सर प्रतिरोधी औषधिहरू प्रति कोषहरूलाई संवेदनशील बनाउन विभिन्न TNBC प्रतिरोधी जीनहरूलाई लक्षित गर्दछ।
CRISPR/Cas9 पुस्तकालयहरू क्यान्सर रोगजननसँग सम्बन्धित जीन उत्परिवर्तनहरू स्क्रिनिङ गर्ने सम्भावित उपकरणहरू हुन् (चान एट अल।, २०२२)। यस स्क्रिनिङ विधिमा चार चरणहरू समावेश छन् जस्तै (क) पुस्तकालय निर्माण, (ख) लेन्टिभाइरल ट्रान्सडक्सन, (ग) फेनोटाइपिक स्क्रिनिङ, र (घ) लक्षित जीन विश्लेषण। यद्यपि TNBC मा MAPK मार्गको असामान्य सक्रियता छ, PTEN, RB1, र TP53 जस्ता ट्युमर सप्रेसर जीनहरूमा उत्परिवर्तनहरू बोक्ने TNBC बिरामीहरूको लागि MEK लक्षित थेरापीको क्लिनिकल पूर्वानुमान धेरै कमजोर छ।
थप रूपमा, CRISPR/Cas9 प्रयोग गर्ने जीन नकआउट स्क्रिनले MDA-MB-231 मा डिहाइड्रोक्याट्रोलको प्रभाव बुझ्न ग्वाटेमालाको फूल र पातको अर्कमा प्रचुर मात्रामा पाइने सबैभन्दा शक्तिशाली र चयनात्मक अणु, डिहाइड्रोक्याट्रोलको परीक्षण गर्यो। चयनात्मक सेल साइटोटोक्सिसिटीको संयन्त्र। TNBC उपप्रकारहरूको मेसेन्काइमल स्टेमनेस विशेषताहरू। यो CRISPR/Cas9-आधारित स्क्रिनले यो पनि पत्ता लगायो कि HSD17B11, 17β-हाइड्रोक्सिस्टेरोइड डिहाइड्रोजनेज प्रकार 11 एन्कोड गर्ने जीन, MDA-MB-231 कोषहरूमा अत्यधिक अभिव्यक्त हुन्छ र MDA-MB-231 कोषहरूको लागि विशिष्ट डिहाइड्रोफाल्कारिनोलमा परिणाम दिन्छ (ग्रान्ट एट। अल।, २०२०)। यसरी, यसले सुझाव दिन्छ कि CRISPR/Cas9 जीनोमिक स्क्रिनिङमा सम्भावित प्राकृतिक यौगिकहरूको क्यान्सर प्रतिरोधी गुणहरू अन्तर्निहित संयन्त्रहरू पहिचान गर्न ठूलो सम्भावना छ।
यसको अतिरिक्त, क्यान्सरको लागि TNBC को जोखिमलाई निष्पक्ष जीनोम-वाइड इन भिभो CRISPR/Cas9 स्क्रिन प्रयोग गरेर अध्ययन गरिएको थियो, जसले ओन्कोजेनिक र ट्यूमर सप्रेसर मार्गहरू बीचको सम्बन्ध देखाएको थियो। mTOR र हिप्पो मार्गका प्रमुख घटकहरूले TNBC मा ट्यूमर नियमनमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्ने रिपोर्ट गरिएको छ। थप रूपमा, अध्ययनहरूले देखाएको छ कि mTORC1/2 र YAP ओन्कोप्रोटिनको औषधीय निषेधले इन भिट्रो ड्रग-म्याट्रिक्स सिनर्जी मोडेल र इन भिभो बिरामी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्टहरू प्रयोग गरेर TNBC को रोगजनकतालाई प्रभावकारी रूपमा रोक्छ। यसबाहेक, टोरिन-१-मध्यस्थता गरिएको mTORC1/2 निषेधले म्याक्रोपिनोसाइटोसिस बढाउँछ, जबकि भेर्टेपोर्फिन-प्रेरित YAP निषेधले TNBC कोशिका मृत्यु निम्त्याउँछ। एकसाथ लिइएमा, यी परिणामहरूले TNBC को लागि उपन्यास र प्रभावकारी उपचारहरू पहिचान गर्न जीनोम-वाइड इन भिभो CRISPR स्क्रिनिङको शक्ति र बलियोपनलाई हाइलाइट गर्दछ (Dai et al., 2021)।
ट्यूमरजेनेसिसमा प्रतिरक्षा प्रणालीको अनियमन एक महत्त्वपूर्ण कारक हो। क्यान्सर कोषहरूले ट्यूमर सूक्ष्म वातावरणमा प्रतिरक्षा कोषहरूको गतिविधिमा हस्तक्षेप गर्ने र प्रतिरक्षा प्रणालीलाई सम्झौता गर्ने सहित प्रतिरक्षा संयन्त्रहरूलाई बाइपास गरेर प्रतिरक्षा क्लियरेन्सबाट बच्छन्। त्यसकारण, सुधारिएको प्रतिरक्षा प्रणाली विकास गर्नु ट्यूमरसँग लड्न एक प्रमुख दृष्टिकोण हुन सक्छ। CRISPR/Cas9-आधारित जीन परिमार्जनको प्रयोगले विभिन्न दृष्टिकोणबाट प्रतिरक्षा डिसफंक्शनसँग सम्बन्धित धेरै मुद्दाहरूलाई सम्बोधन गर्दछ। CRISPR/Cas9 निम्न मार्गहरू मार्फत स्तन क्यान्सर विरुद्ध एन्टीट्यूमर प्रतिरक्षा सुधार गर्न प्रयोग गरिएको छ (चित्र 3)।
चित्र ३. CRISPR/Cas9 इम्युनोथेरापीले TNBC कोषहरूलाई लक्षित गर्दछ। CDK5 को क्षति र PDL1 र CD155 को नकडाउनले प्रतिरक्षा प्रणालीलाई बढाउँछ। त्यस्तै गरी, A2AR को क्षति र HER2, mucin 1 र TEM8 जस्ता TAA हरूको नकडाउनले क्यान्सर कोषहरूलाई मार्ने CAR-T कोषहरूको दक्षता बढायो। CRISPR/Cas9-संचालित T सेल स्क्रिनिङले देखाएको छ कि p38 किनेजको अवरोधले T सेल एन्टीट्यूमर गतिविधि बढाउँछ। CRISPR/Cas9 द्वारा परिमार्जित T सेलहरूले TCR (T सेल रिसेप्टर) को अभिव्यक्ति बढाउँछ, जसको परिणामस्वरूप T सेलहरूमा एन्टीट्यूमर गतिविधि हुन्छ।
इम्युनोथेरापीको लक्ष्य क्यान्सर कोषहरूलाई आक्रमण गर्न प्रतिरक्षा प्रणालीलाई उत्तेजित गर्नु हो। प्रतिरक्षा चेकपोइन्ट प्रोटीनको अत्यधिक अभिव्यक्तिले सामान्यतया अटोइम्यून प्रतिक्रियाहरूलाई रोक्छ तर क्यान्सरहरूलाई तिनीहरूबाट बच्न मद्दत गर्न सक्छ (टोपालियन एट अल।, २०१५)। यी प्रोटीनहरूले प्रतिरक्षा कोषहरूको सतहमा रिसेप्टरहरूसँग बाँधिएर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरूलाई रोक्छन्। धेरै चेकपोइन्ट प्रोटीनहरू (जस्तै CD155 र PD-L1) प्रतिरक्षा कोषहरूमा PD-1 रिसेप्टरलाई लक्षित गर्छन् र स्तन क्यान्सरमा व्यक्त हुन्छन्, विशेष गरी TNBC (Li Y.-C. एट अल।, २०२०)। CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर PD-L1 वा यसको रिसेप्टरको नकडाउनले प्रतिरक्षा प्रणालीलाई TNBC ट्यूमरहरूलाई आक्रमण गर्न उत्तेजित गर्न सक्छ (याहाता एट अल।, २०१९)। थप रूपमा, CDK5 को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता मेटाउने माध्यमबाट PD-L1 अभिव्यक्तिको डाउनरेगुलेसनले भिट्रो र भिभोमा ट्यूमरको वृद्धिलाई रोकेको देखाइएको छ (डेंग एट अल।, २०२०)। स्तन क्यान्सरको इन भिट्रो र इन भिभो मोडेलहरूमा वृद्धि अवरोधले सुझाव दिन्छ कि CD155 को shRNA-मध्यस्थता घटाउँदा स्तन क्यान्सरमा उपचारात्मक प्रभाव पर्न सक्छ (गाओ एट अल।, २०१८)।
CAR T कोषहरूले ट्युमर-सम्बद्ध एन्टिजेनहरू (TAAs) पहिचान गर्ने CAR हरूलाई व्यक्त गर्छन् र तिनीहरूको गतिविधि बढाउन चेकप्वाइन्ट प्रोटीनहरूको नकडाउन प्रयोग गर्न सक्छन् (Li C. et al., 2020)। स्तन क्यान्सरमा CAR T सेल थेरापीका लागि विभिन्न सम्भावित लक्ष्यहरू छन्, जसमा HER2, mucin1, र TEM8 जस्ता धेरै TAAs समावेश छन् (Bajgain et al., 2018)। CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019) प्रयोग गरेर PD-1 नकआउट हुँदा मेसोथेलिन (TNBC BT-459 कोषहरूमा अत्यधिक अभिव्यक्त) लाई लक्षित गर्ने CAR T कोषहरू क्यान्सर विरुद्ध बढी प्रभावकारी हुन्छन् भन्ने प्रमाण छ। यद्यपि, बिरामीहरूबाट T कोषहरू अलग गर्नु र त्यसपछि तिनीहरूलाई ex vivo सम्पादन गर्नु श्रम-गहन र समय-खपत गर्ने प्रक्रिया हो। यद्यपि विश्वव्यापी T कोषहरूले अलगाव आवश्यकताहरू कम गर्न सक्छन्, मानव ल्युकोसाइट एन्टिजेन (HLA) वर्ग I र T सेल रिसेप्टर (TCR) व्यक्त गर्ने दाता T कोषहरू ग्राफ्ट-बनाम-होस्ट असामान्यताहरू रोक्नको लागि हटाउनु पर्छ (Ren et al., 2017)। , २०१७a)। CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर, HDR ले एकैसाथ TCR र HLA लाई हटाउन सक्छ र CAR एन्कोडिङ गर्ने जीनलाई बाहिर निकाल्न सक्छ। अध्ययनहरूले देखाएको छ कि CRISPR/Cas9 लाई TCR लोकसमा एन्टी-CD19 CARs परिचय गराउन प्रयोग गर्न सकिन्छ, जसले गर्दा T कोषहरू घटाइए बिना कुशलतापूर्वक CARs उत्पादन गर्दछ (Dimitri et al., 2022)। TCR, beta-2-microglobulin (B2M), HLA-I सबयुनिट र PD-1 र CTLA-4 जस्ता अन्य प्रोटीनहरूलाई एकैसाथ हटाएर एलोजेनिक CAR T कोषहरू उत्पन्न गर्न मल्टिप्लेक्स प्रविधिहरू विकास गरिएको छ, जसमा TNBC विरुद्ध बढी क्यान्सर विरोधी गुणहरू हुन सक्छन् (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022)।
CRISPR/Cas9 प्रयोग गर्नाले CAR-T कोषहरूको प्रभावकारितामा सुधार आउन सक्छ। एडेनोसिनमा इम्युनोसप्रेसिभ गुणहरू छन् र T कोषको कार्यलाई अवरुद्ध गरेर र एडेनोसिन A2A रिसेप्टरहरू (A2AR) सक्रिय गरेर क्यान्सर प्रतिरोधात्मक क्षमता कम गर्न सक्छ भनेर चिनिन्छ (भिगानो एट अल।, २०१९)। CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर A2AR लाई मौन गर्नाले Vivo मा CAR-T कोषहरूको प्रभावकारितामा उल्लेखनीय सुधार भयो (Giuffrida एट अल।, २०२१)। T कोषहरू सेलुलर विस्तार, भिन्नता, अक्सिडेटिभ तनाव र जीनोमिक तनाव जस्ता विभिन्न फेनोटाइपिक विशेषताहरू प्रदर्शन गर्न जानिन्छन्। CRISPR/Cas9-आधारित T सेल स्क्रिनिङले २५ फरक T सेल रिसेप्टर काइनेजहरूको अवरोध प्रकट गर्यो। तिनीहरूमध्ये, p38 काइनेजको मेटाउने कार्यले T कोषहरूको एन्टीट्यूमर गतिविधि बढाउन देखाएको छ, जसले संकेत गर्दछ कि p38 काइनेज CAR-T कोष नियमनको एक प्रमुख नियामक हो (गुरुसामी एट अल।, २०२०)।
अत्यधिक अभिव्यक्त TCRs उत्पादन गर्न CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर T कोषहरूलाई आनुवंशिक रूपमा परिमार्जन गर्न सकिन्छ। आनुवंशिक रूपमा परिमार्जित T कोषहरू बिरामीहरूलाई स्थानान्तरण गर्दा अन्तर्जात T कोषहरू भन्दा बलियो क्यान्सर प्रतिरोधी गतिविधि देखाइएको छ। त्यसकारण, अन्तर्जात TCRs ले बिरामीहरूमा आनुवंशिक रूपमा परिवर्तन गरिएका TCRs सँग प्रतिस्पर्धा गर्न सक्छ, जसले क्यान्सर इम्युनोथेरापीको सम्भावनालाई असर गर्न सक्छ। यो समस्यालाई पार गर्न, प्राप्तकर्ता कोषहरूमा अन्तर्जात TCR-β हटाउन CRISPR/Cas9 प्रयोग गर्नाले र त्यसपछि क्यान्सर बिरामीहरूलाई TCR-β T कोषहरू स्थानान्तरण गर्नाले अन्तर्जात TCR यौन प्रतिस्पर्धाको आवश्यकता बिना राम्रो क्यान्सर प्रतिरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू प्रदर्शन गर्न सक्छ (फ्यान एट अल। २०१८)। यसरी, CRISPR-परिमार्जित T कोषहरू बाहेक, TCR हरू सामान्य TCR-ट्रान्सड्युस्ड T कोषहरू भन्दा ट्युमर एन्टिजेनहरू प्रति हजार गुणा बढी संवेदनशील हुन्छन्। थप रूपमा, विभिन्न ल्युकेमियाहरूमा, γδ TCR+ CRISPR द्वारा उत्पन्न परिमार्जित T कोषहरूले मानक TCR स्थानान्तरण भन्दा CD4+ र CD8+ T कोषहरूको उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शन गर्दछ (Legut et al., २०१८)। यसरी, CRISPR/Cas9 द्वारा उत्पन्न परिमार्जित T कोषहरू TNBC लाई जित्नको लागि प्रभावकारी इम्युनोथेरापी विधि हुन सक्छ।
इन्टिग्रिनहरू कोशिका आसंजन अणुहरू हुन् जुन कोशिका ट्रान्समेम्ब्रेनमा हुन्छन् र कोशिकाहरूलाई बाह्यकोशिकीय म्याट्रिक्स (ECM) मा बाँध्न प्रवर्द्धन गर्छन् (हामिडी र इभास्का, २०१८)। इन्टिग्रिनहरूको अनियमन क्यान्सरको विकास र माइग्रेसनसँग सम्बन्धित छ बाह्यकोशिकीय म्याट्रिक्स परिवर्तन गरेर, जसले गर्दा रक्तसञ्चारमा क्यान्सर कोशिकाको अस्तित्व हुन्छ (हामिडी र इभास्का, २०१८)। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता इन्टिग्रिन नकडाउनले TNBC मा ट्युमरको प्रगति, मेटास्टेसिस र उपनिवेशीकरणलाई सुस्त बनाउँछ। इन्टिग्रिन a5 (ITGA5) को नकडाउनले फोक्सोको क्यान्सर जस्ता अन्य क्यान्सरहरूमा कोशिका माइग्रेसन र प्रगतिलाई कम गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ (जु एट अल।, २०१७), सुझाव दिन्छ कि इन्टिग्रिन a5 TNBC को रोगजननमा पनि एक प्रमुख कारक हुन सक्छ।
परम्परागत भ्रूण स्टेम (ES) कोष विधिहरू प्रयोग गरेर नकआउट मुसाहरू उत्पादन गर्नु श्रम-गहन, समय-खपत गर्ने, र अकुशल प्रक्रिया हो। समरूप पुनर्संयोजन मार्फत ES कोषहरूलाई लक्षित गर्न, काइमेरिक मुसाहरूलाई प्रजनन गर्न, र त्यसपछि समरूप सन्तान उत्पादन गर्न हेटेरोजाइगस मुसाहरूसँग तिनीहरूलाई पार गर्न महिनौं र वर्षौं लाग्छ। धेरै आनुवंशिक उत्परिवर्तनहरू भएका मुसाहरू सिर्जना गर्न जटिल क्रस ब्रीडिंग आवश्यक छ। यद्यपि, CRISPR/Cas9 प्रयोग गरेर ES कोषहरूको पृथक्करणद्वारा वा CRISPR/Cas9 कम्पोनेन्टहरूलाई एकल-कोषीय निषेचित अण्डामा माइक्रोइन्जेक्ट गरेर उत्पन्न मुसाहरू प्रयोग गर्दा धेरै समस्याहरू उत्पन्न भएका छन्। उदाहरणका लागि, परिवर्तनहरूको परिचय प्रायः बाईलेलिक लोकीमा हुन्छ र यो जीन विशिष्ट हुँदैन। हालसालै रिपोर्ट गरिएको थियो कि CRISPR/Cas9 प्रविधि प्रयोग गर्ने ES कोषहरूले एकैसाथ ५ जीनहरूमा बाईलेलिक उत्परिवर्तनहरू सम्मिलित गर्न सक्छन् (निशिजोनो एट अल।, २०२१)। यस उद्देश्यका लागि, Cas9 mRNA र पाँच जीन-विशिष्ट gRNA हरू एकैसाथ ES कोषहरूमा स्थानान्तरण गरिएका थिए। यसले यस प्रक्रियाको प्रतिज्ञा र प्रभावकारितालाई हाइलाइट गर्दछ, यद्यपि यी उत्परिवर्तनहरू संस्थापक रेखाहरू क्विन्टुपल नकआउट मुसाहरू उत्पादन गर्न प्रजनन गर्दा पारित भएको हुन सक्छ। अध्ययनले एक आश्चर्यजनक खोजको पनि रिपोर्ट गर्दछ: ES कोषहरूलाई अब आनुवंशिक रूपमा परिमार्जित मुसाहरू सिर्जना गर्न आवश्यक छैन। यसको सट्टा, विशिष्ट जीन उत्पादनहरू हटाउन, Cas9 mRNA र gRNA एकल-कोशिका चरण भ्रूणहरूमा इन्जेक्ट गरिएको थियो। फलस्वरूप, नकआउट संस्थापक रेखाहरू सिर्जना गरिएको छ जुन सैद्धान्तिक रूपमा मुसाहरूमा जीन मेटाउने परिणामहरू अध्ययन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ (किन एट अल।, २०१६)। यसरी, CRISPR/Cas9 ले परम्परागत आनुवंशिक इन्जिनियरिङ भन्दा कम लागतमा TNBC को उपचार गर्न ट्रान्सजेनिक मुसाहरूको सिर्जनालाई अनुमति दिन्छ। CRISPR/Cas प्रणाली प्रयोग गरेर, नयाँ नकआउट माउस मोडेल विकास गरिएको छ जसले TNBC मा एक वा बढी अन्तर्जात जीनहरूमा बिन्दु उत्परिवर्तनहरू सफलतापूर्वक परिचय गराउन सक्छ। यस अवधारणाको आधारमा, BRCA1 र p53 को CRISPR/Cas9-मध्यस्थता मेटाउने प्रयोग गरेर TNBC को पशु मोडेलहरू पनि विकास गर्न सकिन्छ, जसको परिणामस्वरूप HR मर्मत, जीनोमिक अस्थिरता, र उत्परिवर्ती फेनोटाइपहरू गुम्छन् (Annunziato et al।, २०२०)।
हाल, TNBC निदान गर्न म्यामोग्राफी, चुम्बकीय अनुनाद इमेजिङ (MRI) र अल्ट्रासाउन्ड जस्ता विभिन्न विधिहरू प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि, यी विधिहरूमा केही सीमितताहरू छन्। क्यान्सर कोषहरू अन्य अंगहरूमा सरेका मेटास्टेसेसको सट्टा स्थानीय स्तन तन्तुको निदान गर्न म्यामोग्राफी प्रयोग गरिन्छ। TNBC निदानको लागि अल्ट्रासोनोग्राफी भरपर्दो विधि होइन (चेन र ली-फेल्कर, २०२३)। MRI मा अल्ट्रासाउन्ड र म्यामोग्राफी भन्दा उच्च संवेदनशीलता छ, तर यसको निदान शुद्धता सीमित छ (शा र चेन, २०२२)। टिस्यु बायोप्सी क्यान्सर कोषहरू पहिचान गर्ने एक आक्रामक तरिका हो। यद्यपि, केही अवस्थामा, यदि सुई रुचिको क्षेत्रबाट टाढा गयो भने बायोप्सीले क्यान्सरको तन्तु छुटाउन सक्छ। थप रूपमा, यो धेरै महँगो छ र बिरामीको लागि दर्दनाक हुन सक्छ। TNBC एक विषम प्रकारको क्यान्सर हो, त्यसैले बायोप्सीले क्यान्सरको प्रकारको बारेमा पर्याप्त जानकारी प्रदान नगर्न सक्छ। त्यसकारण, TNBC पत्ता लगाउनको लागि नयाँ निदानात्मक रूपमा भरपर्दो विधि तुरुन्तै आवश्यक छ। CRISPR/Cas9 स्तन क्यान्सर निदानको लागि अत्यधिक संवेदनशील र न्यूनतम आक्रामक विकल्पको रूपमा काम गर्न सक्छ। यस उद्देश्यका लागि, TNBC को निदानको लागि PCR विधिहरू सुधार गर्न CRISPR/Cas9-आधारित रणनीतिहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ। पहिले, CRISPR प्रणालीको Cas9 र cpf1 प्रोटीनहरू गैर-विशिष्ट DNA हटाउन प्रयोग गरिन्छ, र त्यसपछि यी दुई प्रोटीनहरू (Cas9 र cpf1) ले लक्षित DNA मा बाँध्नु अघि PAM अनुक्रम पहिचान गर्न सक्छन् (दीपक सिंह एट अल।, २०२१)। । यसरी, PCR ले क्यान्सर विकाससँग सम्बन्धित उत्परिवर्तनहरू पहिचान गर्न सक्छ। विभिन्न क्यान्सरहरूमा विभिन्न उत्परिवर्तनहरू पत्ता लगाउन धेरै अध्ययनहरूले यो CRISPR-आधारित रणनीति अपनाएका छन् (सफारी एट अल।, २०१९)। यसरी, CRISPR-आधारित PCR विधिहरूले बायोप्सी-आधारित इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री जस्ता आक्रामक विधिहरूमा TNBC निदानको निर्भरता कम गर्न सक्छ।
TNBC मा पनि हार्मोन रिसेप्टर नियमनमा जीनोटाइपिक परिवर्तनहरू प्रदर्शन गरिएको छ (चेन र रुसो, २००९)। पोइन्ट-अफ-केयर डायग्नोस्टिक्सको लागि माइक्रोएरे प्रयोग गर्ने CRISPR/Cas9-आधारित PCR रणनीतिहरूले यी उत्परिवर्तनहरूलाई प्रभावकारी रूपमा निगरानी गर्न सक्छन् (हाजियान एट अल।, २०१९)। यसले स्वास्थ्य सेवा प्रदायकहरूलाई TNBC बिरामीहरूमा विशिष्ट उत्परिवर्तनहरूको बारेमा सान्दर्भिक जानकारी पनि प्रदान गर्न सक्छ, जसले उनीहरूको उपचार पाठ्यक्रम सुधार गर्न मद्दत गर्न सक्छ। यद्यपि, यो संयुक्त प्रविधिको सीमितताहरू छन्। त्यसकारण, TNBC को निदानको लागि स्वास्थ्य सेवामा यो CRISPR/Cas-PCR विधि प्रयोग गर्न सक्नु अघि व्यापक अनुसन्धान प्रयासहरू आवश्यक छ (यांग एट अल।, २०१९)।
पोस्ट समय: अक्टोबर-१४-२०२४